微生物学报ActaMicrobiologicaSinica49(11):1477-1482;4November2009ISSN0001-6209;CN11-1995/Q im. ac. cn/actamicrocnResearchPaper灰黄青霉Pa．pex ll基因对青霉素产生的影响杨晶1,2，安洋1'2，徐欣欣1'2，刘钢n（1中国科学院微生物研究所中国科学院真菌地衣系统学实验室，北京）（2中国科学院研究生院，北京）摘要：【目的】研究灰黄青霉Pa- pexll对青霉素产生的影响。【方法】通过保守序列设计引物从灰黄青霉中克隆了含有pex11同源基因DNA片段，进而通过热不对称交错PCR(Thermal asymmetric interlacedPCR，TailPCR)扩增得到灰黄青霉中Pa-pex11基因的全序列。利用根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)系统，在灰黄青霉基因组上导入额外的Pa-pex11基因。对灰黄青霉野生型菌株和转化子进行了青霉素发酵及生物活性测定。通过荧光定量PCR( quantitativePCR)对转化子中的Pa- pex11拷贝数进行了相对定量。同时通过透射电镜观察了菌体中微体数量的变化。【结果】实现了灰黄青霉根癌农杆菌介导的遗传转化，获得了在灰黄青霉基因组上插入额外Pa- pex11基因的转化子，在转化子中青霉素产量较野生型菌株提高了1.7倍，电镜照片显示转化子中微体数量明显增加。【结论】通过在基因组中增加Pa-pexl1拷贝数能有效地增加灰黄青霉微体的数量，进而提高青霉素的产量。关键词：Pa- pex11基因；ATMT；青霉素；微体中图分类号：Q933文献标识码：A文章编号：0001-6209(2009)11-1477-06微体是真核细胞内一种重要的圆形细胞器，具有单层膜结构，因其基质中含丰富的参与各种代谢途径的蛋白和酶类也被称为过氧化物酶体…。微体在动植物体内是重要的细胞器，参与B一氧化、乙醛酸循环以及胆固醇合成等多种代谢途径心-3。一些可遗传的哺乳动物代谢紊乱如Zellweger综合症、Refsum病与微体形成缺陷相关H1。而在丝状真菌中对微体的研究还不详细，但是它也发挥着重要的生物学功能，如可能参与丝状真菌合成B一内酰胺类抗生素巧3。也有报道称微体与粗糙脉孢菌及米曲霉伏卢宁体的形成相关№1。包括青霉素和头孢菌素在内的0．内酰胺类药物，是最为常用的一大类广谱抗生素。自从1929年Fleming发现青霉素以来，青霉素的产量较最初相比至少提高了1000倍。研究发现其中一部分青霉素产生菌株，如产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans），青霉素产量的提高是由于胞内微体的数量和膜面积得到了显著增加"1。产黄青霉Pc-pex11基因编码的Pexllp蛋白，是位于微体膜中的一种蛋白，与青霉素的产量及微体膜的分化相关阳1。灰黄青霉（Penicillium ）是一株产青霉素的菌株。本实验室的前期工作曾在其基因组DNA中扩增到青霉素合成相关基因pcbAB和pcbC，并对其发酵液中青霉素G产量进行了初步测定（安洋等，内部交流）。本文研究的目的在于通过增加Pa-pex11在基因组DNA中的拷贝数，来研究Pa-pex11是否能促进微体的分化，进而提高灰黄青霉中青霉素的产量。基金项目：国家科技支撑计划(2007BAI26B01)+通信作者。Tel：+86-10-;E-mail: liug@ sun．im．ac cn作者简介：杨晶（1984-），女，四川自贡人，硕士研究生，主要从事丝状真菌次生代谢产物分子调控相关的研究。E—mail: yangjing106@ mails gucas．ac cn收稿日期：2009-04-24：修回日期：2009-05-11JingYang et (2009)49(11)1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒：灰黄青霉（Penicillium ）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus l.1848）购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCCC)；根癌农杆菌AGL-1（Agrobacterium tumefaciensAGL-1）由何朝族研究员惠赠；大肠杆菌JM109和pBluescriptⅡKS（一）购自Stratagene公司； pUAC43为本实验室保存；pCAMBIA1302-lx-l-l由方荣祥研究员惠赠主要试剂：限制性内切酶，T4DNA连接酶， dNTP，pMD19TKit购自宝生物工程（大连）公司；TaqDNA聚合酶购自Genescript公司；青霉素G购自经科宏达生物技术公司；PowerSYBRGreenPCRMIX购自AppliedBiosystems公司；其它常规生化试剂均为国产分析纯引物：由Invitrogen公司合成（表1）。表l本文所使用的引物Table lPrimers used in this paper┏━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┓┃┃┃┃Source or┃┃Primer┃Sequence(5"3')┃71m／℃┃┃┃┃┃┃reference┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃pex01┃CGGGATCCCTCCGCACAATCCAATAC┃54┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃pex02┃CGGAA'ITCACCAACAGCAGACAAACC┃54┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PL1┃AACTATTGCA17GTCCCCAC┃55.2┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PL2┃CGAGGAA'ITrGCCCATACGC┃63┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PL3┃CTCGAGACTCAACTACCCGG┃573┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PR2┃TGGCAITCGGAAACTCTCTT┃58┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PR2┃CAAGACTA'ITGACCCTAACG┃49.1┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃PR3┃TGCCAATGGGCAATGTATCC┃60.3┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃AD1┃NCTCCASWCANAWGAA┃┃[9]┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃AD5┃NTCCASTWTSCWCIT┃┃[9]┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃pexIIL┃CCCAATTCACA'ITACATCCTCCCTCCC┃55┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃pexllR┃CGGGATCCTATCAACCGACACGCTGC┃55.5┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃bleF┃TCCTGCTCCTCCGCCAC┃58┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃bleR┃AAGTI'CACCAGTCCCCITCC┃62┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃pexf┃GTCATCGATGTGA'ITCCCAT┃59.3┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃┃1TCTCCTGCAGACGAACAAG┃59.1┃This study┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃actlf┃AGTCCAAGCCTGCTATCCT┃58┃[10]┃┣━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━┫┃actlr┃ACTrCGGGTTGATGGCAG┃56┃[10]┃┗━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┛Restriction sites(BamHI andEcoRI) used for cloning are 培养基：YPD（酵母粉1010，蛋白胨2010，葡萄糖2%）；LYP（乳糖1.5%，酵母粉0.5010，大豆蛋白胨0.5%,NaCl10r/0,MgS04'%,%,%,%，琼脂2.5%)；种子液培养基MCIP（玉米浆2%，酵母粉1%，蔗糖2010，，NaOH调pH至5.7）；发酵培养基MCFP（玉米浆3.5010，乳糖5.5%，CaC031%，MgS04.7H：00.3%，KH：P040.7%)；TB（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂0.8010，)-pexll的克隆根据产黄青霉Pc-pexl1基因内部保守区设计引物pex01和pex02，以灰黄青霉基因组DNA为模板，PCR扩增得到Pa- pex11内部DNA片段并连接到载体pBluescriptⅡKS（一）上。扩增条件为初始变性(94℃4 min)，扩增循环(94℃1 min，53℃50 s，72℃lmin，30个循环)，延伸(72℃8 min)。从得到的黄灰青霉Pa-pex11基因内部的序列各设计3条嵌套引物（PL1、PL2、PL3和PR1、PR2、PR3），避开可能的内含子所在的序列。随机引物采用AD1和AD5。采用热不对称交错PCR(TailPCR)L9]的方法经过三轮PCR分别扩增得到Pa-pex11上下游序列，分别克隆到pMD19T载体上并进行序列测定。根据获得的Pa-pex11上下游序列设计引物pexllL和 pexllR，以灰黄青霉基因组DNA为模板，PCR扩增Pa-pex11全长序列。扩增条件为初始变性(94℃5 min)，扩增循环(94℃1 min，58℃1 min，72℃2 rmn，30个循环)，延伸(72℃10 min)根癌农杆菌介导的灰黄青霉转化1.3.1农杆菌转化质粒的构建：用XhoI和EcoRI双酶切pUAC43，回收带P。。。。启动子的博莱霉素抗性基因ble表达元件。pCAMBIA1302-lx-l-l经XhoI和EcoRI双酶切去除潮霉素磷酸转移酶基因hyg后，与ble表达元件连接，构建得到农杆菌转化的载体 p1302:：ble。将PCR扩增得到的含有完整Pa-pexll基因的DNA片段用EcoRI和BamHI酶切纯化后，与p1302:: ble载体多克隆位点连接，得到质粒 p1302：：ble：：Pa-pexl l。将pl302：：ble：：Pa-pex11转化农杆菌AGL-1。农杆菌感受态的制备与转化参考文献[1刚，随机挑选农杆菌转化子，并通过菌液PCR验证。1*3.2农杆菌介导的灰黄青霉转化：选择萌发10 h，浓度为106个/mL的灰黄青霉孢子为受体材料，与含有p1302：：ble：：Pa-pexl1质粒的AGL-1共培养24 h。其它转化条件参考文献[Il]转化子的鉴定：转化子孢子悬液接种于YPD液体培养基，28c|C，220 r/min条件下培养2d，离心收集菌体。氯化苄法n纠提取转化子基因组DNA，以此为模板，以bleR和bleF为引物进行PCR扩增博莱霉素抗性基因内部368 bpDNA片段。同时以灰黄青霉野生型菌株基因组DNA为对照。扩增条件为杨晶等：灰黄青霉Pa- pexll基因对青霉素产生的影响，／微生物学报(2009)49(11)初始变性(94℃5 min)，扩增循环(94℃30 s，63℃30 s，72℃30 s，30个循环)，延伸(72CC10 min)转化子Pa-pex11拷贝数的确定：通过优化条件以荧光定量PCR( quantitativePCR)确定Pa-pex11在基因组上的拷贝数，以看家基因y-actin为内参。 y-actin基因PCR引物为actlf和actl r，Pa-pex11PCR引物为pexf和pexr，分别以转化子和野生型菌株基因组DNA为模板进行扩增。qPCR扩增条件为初始变性(94℃4 min)，扩增循环(94℃30 s，60℃30 s，72C30 s，40个循环)，延伸(72℃5 min)。每个循环76℃，80cC各读板一次。得到Ct值后2-AACT换算进行相对定量青霉素的发酵将l×l07个／mL灰黄青霉孢子接种于50 mLMCIP中，28℃，220 r/min培养2d；取种子发酵培养物按10%接种量接种于100 mLMCFP中，添加0.4010苯乙酸前体后于28℃，220 r/min培养青霉素检测发酵液每隔24 h取样，以藤黄微球菌为指示菌进行检测。藤黄微球菌在LB液体培养基中28℃，220 r/min培养2d，按1%添加到TB固体培养基中，待培养基凝固后，打上大小一致的孑L洞，并加入100VL不同时间点发酵液样品，于28℃培养16 h后测量抑菌圈直径。同等条件以不同稀释度青霉素G标准品制作标准曲线菌体干重的测定同一批次发酵培养基，每隔24 h过滤收集100 mL发酵培养基菌体，烘干称重电镜观察微体数量选取114 h发酵菌体，制作切片，并通过透射电镜观察细胞内微体数量。以同一时间点野生型灰黄青霉菌体为对照。2结果 ll的克隆参照产黄青霉Pc- pexll基因序列，以保守区设计引物，通过PCR扩增得到部分灰黄青霉Pa-pex11基因，进而通过Tail-PCR克隆得到了含有灰黄青霉Pa-pex11全基因及其上下游约2 kb的DNA片段。对该片段进行序列测定。序列分析表明，该片段仅含有一个开放阅读框即Pa-pex11基因，长度为993 bp，含有2个可能的内含子，编码238个氨基酸，同源比对发现其N端含有一个保守的微体靶定位序列，蛋白内部还具有两个跨膜区（图1）。同源比对发现灰黄青霉来源的Pa-pex11基因推测的编码产物与产黄青霉Pc-Pexll蛋白具有很高的序列相似性()。得到的Pa-pexl1基因已提交了GeneBank，基因序列号为FJ。(A)髟r——髟勿芴芴勿勿纩园Exon口Intron(B)锺ll≥N-terminal conserved signal peptide露嚣'Transmembrane domain图1Pa-pexll基因结构及推测蛋白结构域示意图 gene structure and the predicted structure ofPa-Pexll :Pa-pexll gene wich three exons;B:The predictedN— ierminal signal and transmembrane domain 灰黄青霉Pa-pex11转化子的构建通过农杆菌介导的转化系统(ATMT)将构建好的质粒p1302：：ble：：Pa-pex11导人灰黄青霉中。以10Ug/mL博莱霉素抗性浓度筛选p1302：：ble：：Pa- pex11转化子。随机挑选转化子，提取转化子基因组DNA，PCR验证表明ble成功地插入到灰黄青霉基因组上（图2）。(A)EcoRIBamHIPaV";7Skb'纛圈图2灰黄青霉农杆菌转化质粒的构建(A)及转化子PCR验证凝胶电泳(B)Fig2Construction of plasmid p1302:: ble::Pa-pexll(A) and confirmation of the transformants byPCR(B).The muhiple cloning sites compose of restriction sites forEcoRI,BamHI,Pstl,Hindlll,Nhe工 l-4: random selected transformants;Lane5:positive control;Lane6:negative control;LaneM:100bp et (2009)49(11)2.3转化子中Pa-pex11的相对拷贝数随机选取其中一株转化子tz4，经YPD培养后提取基因组DNA，同时以野生型菌株基因组DNA为对照。经qPCR得到Ct值，以2-AAC‘法相对比值换算如表2所示，其中看家基因7一actin作为内参。换算数值显示tz4基因组上Pa-pex11基因的拷贝数为野生型菌株的1.9倍。表2野生型灰黄青霉(WT)与转化子tz4Pa-pexll基因拷贝数相对比值计算Table2Results of real time qPCR calculated by the method of2-△△n┏━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━┓┃ actl┃ pexl1┃△Ct┃△△Ct┃2-△△c'┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃WT21.70┃20.56┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.78┃20.63┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.45┃20.54┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.64┃20.58┃-1.06┃0┃1(0.89┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃8”昭┃土0.17┃土0.17┃-1.12)┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃tz421.38┃19.61┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.39┃19.28┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.37┃19.24┃┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃21.38┃19.376┃-2.00┃-0.94┃1.91(1.67┃┣━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━┫┃“8岍?2.2)┃┗━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━┛2.4青霉素G发酵产量以不同浓度梯度青霉素G标品绘制青霉素G标准曲线(青霉素G标准品浓度为：2-100 tiglmL)。3530一蛊25皇20．皇p d)享 l5 b4168Fermentation time/h8Fermentation time/h图3不同时间点灰黄青霉野生型与转化子菌株青霉素产量(A)及菌体干重(B) of penicillin production(A) and mycelium dry weight(B) in different fermentation time.A:penicillin production( mg/L);B: mycelium dry weight(g/L).WT, the wild type strain; tz4, transformant with extra copy ofPa-pexll.得到抑菌圈直径(x)与抗生素浓度对数值(y)的直线方程：y=。灰黄青霉发酵从第3天开始产生青霉素，第4天有较小的抑菌圈出现。 tz4发酵产量与野生型菌株比较选取从第4天开始。换算野生型菌株与转化子tz4青霉素G产量，如图3-A所示，野生型菌株青霉素G在发酵第5天后达到平稳期，而同样条件下tz4抗生素产量呈对数增长。发酵至第7天时，tz4青霉素产量是野生型菌株的1.8倍。同时比较tz4与野生型菌株不同时间点菌体干重发现，tz4菌体干重比同等条件野生型菌株略高，如图3-B。从单位质量的菌体产生抗生素的能力来看，tz4每克菌体产生青霉素G的能力是野生型菌株的1.电镜结果取发酵114 h的灰黄青霉野生型和tz4菌体，经戊二醛固定，超薄切片，并通过醋酸铀和硝酸铅染色制作透射电镜样品。电镜显示细胞内具有多种膜结构细胞器，在醋酸铀与硝酸铅的染色后具有不同的电子密度，而与胞内其它的结构具有不同的相差。图4野生型菌株与tz4电镜下细胞结构 micrographs of peroxisomes cells.A: wild type cell;B:tz4 are indicated by bar represents l ym.Ln o rr)322-,-(1／sm)/uoponpoId ullIlo!uad杨晶等：灰黄青霉Pa- pex11基因对青霉素产生的影响，／微生物学报(2009)49(11)1481图中用箭头标识出了微体结构，相比较于灰黄青霉野生型菌丝内部的结构（图4-A），在tz4细胞内微体数量明显增多，但是体积未见变大（图4-B）。3讨论利用ATMT介导的遗传转化方法在多种丝状真菌中已经获得成功应用，但是在本文所涉及的灰黄青霉菌株中的应用尚属首次。本文通过遗传学的手段在灰黄青霉基因组上增加了Pa- pex11基因的拷贝，成功地提高了青霉素的产量。合成青霉素所需要的几个关键酶，在细胞内定位于不同的位置。对其合成途径区室化的研究表明，其中一个关键酶异青霉素N:乙酰CoA乙酰转移酶就具有微体靶定序列，如果缺失该定位信号，合成青霉素的能力也将丧失，可见微体在青霉素的合成中起着重要的功能。Kiel等人在产黄青霉中过表达Pc-Pexllp发现青霉素产量提高了2倍，但合成途径中几个关键酶表达水平无明显变化随1。而本文Pa- pex11编码的蛋白Pa-Pexllp也具有促进微体膜蛋白分化的功能，使得增加一个Pa-pex11拷贝数的转化子细胞内微体数量明显增加，推测青霉素产量提高的原因是Pa- pex11能促进微体的分化，微体数量的增加有效地增加了膜面积，进而提高了摄人前体和分泌抗生素的能力。本文Pa- pex11的例子也为定向改造抗生素高产工程菌提供了新思路。可以通过筛选和发现更多的抗生素分泌相关基因，在不涉及抗生素合成相关酶表达水平的前提下，从提高抗生素的分泌能力人手来提高抗生素产量。致谢衷心感谢中国科学院微生物研究所电镜室的梁静南老师为本文制备透射电镜超薄切片样品。同时感谢中国科学院微生物研究所的方荣祥院士和何朝族研究员为实验所提供的农杆菌转化用的质粒 pCAMBIA1302-lx-l-l及菌株AGL-1。参考文献[1]VeenhuisM,//RoseAH,,4:' :AcademicPress．1991．[2]ParsonsM,FuruyaT,PalS,et and function of peroxisomes and ,2001,115(1):19-28.[3]MullerWH,Van derKriftTP,KrouwerAJ, et of the pathway of che penicillin biosynthesis inPenicillium ,1991,10(2):489-495．[4]GouldSJ,ValleD,Peroxisome biogenesis disorders: genetics and cell 琉Genetics,2000,16:340-345．[5]MartinJF, for beta-lactam antibiotic ,1995,67,181-200．[6]EscanoCS,JuvvadiPR,JinFJ,et of theAopexll-1 gene involved in peroxisome proliferation leads to impaired woronin body formation inAspergillus ,2009,(8):296-305.[7]MullerWH,BovenbergRA,GroothuisMH, et of microbodies in penicillin 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ofSciences,Beijing,China)(2GraduateSchool ofChinese academy ofSciences,Beijing,China)Abstract:[Objective]To study the effect ofPa-pexll gene on penicillin production aurantiogriseum.[Method]Based on the conserved domain of pexll fromPenicillium chrysogenum, we designed primers pex01 and pex02 to amplifyPa- pexll gene fromP. completePa-pexll gene was cloned via thermal asymmetric interlacedPCR(Tail-PCR).In order to obtain tranformants with additionalPa-pexll gene copy,ATMT(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation) was used to transformP. copy number ofPa-pexll was measured by production of the transformant was analyzed by bioassays and the microbodies were observed by transmission electron microscope(TEM).[Results]ATMT was successfully applied inP. aura, the copy number ofPa-pexll gene resuhed in a l.7-fold increase of pencillin production, and the electron microscope graph showed that the number of microbodies increased obviously.[Conclusion]Our results suggest that increasing the copy number ofPa-pexll can increase the number of microbodies, and stimulate the penicillin :Pa-pexll gene;Agrobacterium mmefaciens mediated transformation(ATMT); penicillin; microbodiesSupported by theKeyProject ofNationalScience&TechnologyPillarPrograme(2007BAI26B01)'Corresponding :+86-10-;E-mail::24April2009/Revised:11May2009（本文责编：王晋芳）